一、實驗目的

酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，植物體內(nèi)的生化反應一般都在酶的作用下進行，沒有酶的催化反應，植物生命也就停止了，因此對酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。研究酶先要將酶從組織中提取出來，加以分離、純化，不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不同，有些工作只需粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，根據(jù)不同情況區(qū)別對待。在酶的提取和純化過程中，自始至終都需要測定酶的活性，通過酶活性的測定以監(jiān)測酶的去向。

二、實驗原理

（1）酶的提取

1.酶存在于動植物以及微生物的細胞的各個部位。

2.酶如何從細胞中分離

??從高等植物中提取酶常遇到一些實際問題，先是細胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細胞總蛋白質(zhì)中的小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低。此外，各種酶的存在狀態(tài)不同，有外酶、內(nèi)酶，內(nèi)酶中有與細胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶，也有的存在于細胞質(zhì)中，提取時都應區(qū)別對待，作不同處理。如果酶僅存在于細胞質(zhì)中，只要將細胞破碎，酶就會轉(zhuǎn)移到提取液中；但如果是與細胞器（如細胞壁、細胞核、線粒體、原生質(zhì)膜、微粒體等）緊密結(jié)合的酶，這時僅破碎細胞還不夠，還需用適當?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來。其次，細胞中存在抑制物質(zhì)，如酚，酸，離子等，它們通常在液泡中，當細胞破碎時，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細胞中釋放出來，進入提取液中，特別是酚類物質(zhì)，具有游離的酚羥基，能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強的氫鍵，不能為一般的實驗方法，如透析和凝膠過濾所解離。如果沒有特殊需要，一般選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液，在高pH值時，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強的氫鍵，但高pH值促進酚類氧化，同時降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。PVP能與游離酚羥基形成強的氫鍵復合物，是酚類化合物的有效結(jié)合劑。在提取線粒體時加入可溶性PVP，提取可溶性酶時加入不溶性交聯(lián)PVP，能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體，可加10% HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP可直接應用。

植物細胞有堅韌的細胞壁，需要強烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動勻漿器。為減低研磨或勻漿過程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大。提取勻漿時加入酚類結(jié)合劑PVPP，金屬螯合劑Na2─EDTA，以及─SH化合物以保護蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如Triton X─100，以增加蛋白質(zhì)的可溶度，常用于與膜脂結(jié)合的酶。（可以通過試驗以確定提取蛋白質(zhì)的最佳條件。）

（2）離和純化

1.上面制備得到的提取液中，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。

2.如何將酶從粗提液中分離純化

要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法，往層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之一，在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質(zhì)酶活性最大。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集，再溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì)，再經(jīng)過柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也不同，分子篩類型凝膠過濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了。對于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯度溶液進行洗脫，最-方便的是線性梯度濃度，當然用非線性梯度會得到更好的分離效果。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣，已成為常規(guī)酶的分離提純步驟之一。

??近年來純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來分離、提純酶。先選擇支持物，如瓊脂糖將底物、競爭性抑制劑或輔酶，以共價鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過裝有專一性底物、競爭抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì)，然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑或輔酶的緩沖液，進行競爭性洗脫。（親和劑選擇合適，能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又有效的一種方法。）

（3）酶活力的測定

酶的活力表現(xiàn)為催化某一反應的速度，反應速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反應速度可以用單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來表示。由于酶的催化作用和周圍環(huán)境的關(guān)系十分密切，環(huán)境的溫度、pH、離子強度等都對酶的活力有很大的影響，因此測定酶活力時應該使這些條件保持恒定。

酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產(chǎn)物量）μmol數(shù)表示。測定酶活性的方法很多，常因反應的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同選用不同的方法，應用最-廣泛的是比色法或分光光度法。凡反應系統(tǒng)中的化合物在紫外區(qū)或可見光區(qū)有吸收峰的都可以用這種方法進行測定。如果催化的反應系統(tǒng)中需要ATP或產(chǎn)生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脫氫酶和氧化還原酶；或反應產(chǎn)生H2O2，如一些氧化酶，這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學發(fā)光方法進行測定。測定酶活性的方法很多，應根據(jù)具體情況選擇合適的方法。